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土壤微生物檢測對土壤微生物進行研究的方法
發(fā)布時間： 2016-11-25 點擊次數(shù)： 2900次在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，在土壤微生物檢測土壤中生活有數(shù)量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結(jié)構(gòu)微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)。由于土壤微生物的復(fù)雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落后。隨著多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸測序等現(xiàn)代生物學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術(shù)的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數(shù)據(jù)，為直接探究土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)提供了客觀而全面的信息。
1、土壤微生物檢測微生物平板培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)分析大多是將微生物進行分離培養(yǎng)，然后通過一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現(xiàn)型來分析，局限于從固體培養(yǎng)基上分離微生物。這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養(yǎng)的微生物類群，無法對絕大多數(shù)微生物的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的深入研究。
2、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合測序的方法
在過去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其16SrDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鑒定未知菌的研究中。20世紀(jì)80年代以來, 逐步建立起了以分子系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎(chǔ)的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法,使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。其中運用比較廣泛并被普遍認(rèn)可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 堿基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數(shù)量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能*保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現(xiàn)序列不同的DNA 遷移在同一位置的現(xiàn)象。
3、高通量測序方法
研究表明，400～600堿基的序列，足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和準(zhǔn)確性高的特點大量用于微生物多樣性的研究。有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應(yīng)的微生物種類，但更為的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析高通量測序的*性體現(xiàn)在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區(qū)域； 測序通量高，可以檢測到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強；無需進行復(fù)雜的文庫構(gòu)建，微生物DNA擴增產(chǎn)物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數(shù)據(jù)便于進行生物信息分析。該方法得到*期刊的認(rèn)可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序并進行生物信息學(xué)分析。高通量測序因其數(shù)據(jù)量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應(yīng)出土壤樣本的真實情況。
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